Nature | 革新的蛋白互作组研究：酵母相互作用的全面分析

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早在20多年前，人们就已经开始利用基于质谱的蛋白组学对细胞内的互作组进行研究¹，在过去的两项研究中，研究人员曾成功对酵母中近半的蛋白组进行了纯化，并确定了蛋白彼此之间的相互作用关系^2,3。通过对这些数据的深入挖掘，基于网络的细胞内蛋白组学得以逐渐被揭示。

互作组对于理解蛋白功能至关重要，在过去的几十年里，得益于质谱技术的重大进步，研究者们得以逐渐描绘出特定物种在特定状态下，所有蛋白质所形成的大规模且完整的互作组。

2023年11月15日，来自马克斯-普朗克生物化学研究所Matthias Mann在Nature上在线发表了题为The social and structural architecture of the yeast protein interactome的科研论文，本研究开发了一种敏感的高通量检测检测手段，利用高度可重复的亲和富集，结合质谱、定量二维分析等策略，对酿酒酵母的互作组进行了全面的绘制。

本研究通过利用携带内源GFP标签、涵盖4,159个蛋白的酵母文库，在酵母标准生长条件下，对蛋白进行分析。研究者对整个工作流程进行了小型化和标准化处理，超强的液相质谱系统耦合灵敏的捕获离子淌度质谱仪 (trapped ion mobility mass spectrometer)，使得他们能够对蛋白pull-down的产物进行高度完整的数据分析。整个流程仅仅需要1.5 ml的酵母细胞，平均单日可以以相同的实验条件进行恒定的60次pull-down实验 (各种丰度的可溶蛋白、膜蛋白均可进行) (图1)。

图1. 本研究工作流程示意图

在数据分析的过程中，两个之间的相互作用依靠三层证据来建立：如果在正向和反向pull-down实验中，被捕获的蛋白都可以被诱饵蛋白显著富集，那么就满足了前两层证据。在第三层证据中，为了减少实验中的假阳性，研究者使用了大量含有不同GFP标签的酵母株系，并将这些株系合并为单一的对照组进行分析 (图2)。为了从数据中获取聚类和复合物的信息，研究者使用Markov聚类，将互作得分作为边缘权重，其中不涉及任何的训练和先验知识。这些结果为细胞内蛋白组学研究提供了重要的见解，对于理解蛋白功能和相互作用关系具有重要意义。

图2. 二维互作评分系统

通过Markov聚类对蛋白相互作用网络进行分析后，这些网络被压缩成了617个聚类，包含约20,000个相互作用，这些相互作用大部分都被具有显著统计学意义的证据支持。在对不同亚细胞分区中的已知蛋白复合物 (尤其是膜蛋白复合物) 进行进一步分析时，可以发现数据分析结果可以在很大程度上与已发表的结果相吻合。文中，研究者以内体逆转运复合物 (endosomal retromer complex)、多聚高尔基体复合物以及质膜外分泌复合物为例，展示了这一结果 (图3a)。此外，本文的分析还发现了与已知复合物紧密关联的新的亚基，如，内质网膜寡糖转移酶 (oligosaccharyl transferase, OST) 复合物的三个亚基与α-1,2-甘露糖苷酶 (α-1,2-mannosidase, Mns1) 紧密相关，这为我们对蛋白相互作用和细胞内复合物的理解提供了新的见解。

通常而言，常规的聚类算法很难对复合物之间共有的组分进行分析，然而，本研究中高度定量化的数据却可以实现这一点。通过将网络布局算法应用于转录因子TFIID和SAGA复合物的组分，研究者得以重构这些复合物的组成，并对他们彼此之间共有的组分进行指认。研究者还利用内源GFP标签对超过3,405个检测到的诱饵蛋白进行研究，发现GFP肽的质谱信号能够有效地对每个诱饵蛋白进行量化 (图3b)。

图3. 利用高质量的数据集对互作组进行分析

由于蛋白标签的融合会影响复合物的功能或稳定性，在过去的研究中，以CCT复合物 (chaperonin containing t-complex) 为代表的一些蛋白复合物，其组分从未被完整揭示。利用本文所使用的方法中，除了8个保守的、成环的组分外，研究者还鉴定了CCT复合物的21个互作蛋白，其中有近半从未被报道过 (图4d)。鉴于本文所探究的一些例子仅仅是数据中很小的一部分，研究者将在数据上能够被显著支持的蛋白-蛋白相互作用集合成了一个网站 (www.yeast-interactome.org)，以供人们探索自己感兴趣的相互作用 (图4e)。

图4. 蛋白互作网络的分析及集合网站

随后，研究者利用超过4,400个酿酒酵母蛋白，对蛋白的相互作用进行了大规模筛选，其中有74.1%的蛋白含有至少2个相互作用伴侣，15.1%含有1个，而10.8%的蛋白则不存在明显的相互作用关系，为进一步对这些无相互作用的蛋白进行验证，研究者还改变了蛋白标签的融合部位以排除这一因素所带来的干扰。通过这些实验，研究人员得以揭示酿酒酵母蛋白之间复杂的相互作用网络，并发现几乎所有酿酒酵母蛋白都存在与其他蛋白的相互作用。

过去几十年针对酿酒酵母的深入研究，使其成为目前为止被了解得最为清楚的单细胞真核生物之一，这些研究揭示了许多关键且保守的细胞功能，如细胞代谢、DNA复制和转录机制、蛋白质量控制和修饰等。尽管如此，本文互作组的研究还是揭示了许多此前并未在BioGRID数据库中被表征过的蛋白和相互作用。例如，有11条证据提示一种名为YDL176Wp的蛋白与保守的GID (glucose-induced degradation) 复合物存在相互作用 (图5c)，而这在过去只在少有的文献中有过报道；YJR011Cp被发现与保守的转录及翻译调节蛋白CCR4存在关联 (图5h)；而YHR131Cp被发现与激酶CK2的3个亚基存在关联，YLR407Wp则与其第4个亚基存在关联 (图5o)。

图5. 大量新的互作关系被揭示

在此基础上，研究者进一步利用蛋白质结构预测的手段对本研究互作组的数据进行了三维结构层面上的延拓。CK2作为真核细胞中关键的激酶，参与到许多细胞反应途径中，而这些途径诸多与癌症的发生相关。CK2全酶由2个调节亚基和2个催化亚基共同组成 (Ckb1、Ckb2以及Cka1、Cka2) ，在前期研究中，研究者发现CK2与YLR407Wp之间存在直接相互作用。针对YLR407Wp的结构预测发现，该蛋白含有一个功能未知的保守结构域 (DUF4050)，该结构域含有多个磷酸化位点，提示该蛋白或许能在激酶的作用下产生构象变化 (图6)。基于以上发现，YLR407Wp被重新命名为Gag1，而Cka1和Cka2这两个催化亚基之间的结构差异，或许能够解释Cka2对Gag1的选择性结合。

图6. 利用结构预测手段对互作组进行进一步分析

综上，本研究建立了一种新的、高度可扩展的相互作用鉴定手段，利用少量的生物材料就能够最大限度地对蛋白互作网络进行重构。实验结果表明，高置信度的相互作用数据为深度学习模型提供了理想的基础，可以从其序列中预测复合物结构，从而得到功能相关的新型结构模型。这一工作流程在后续可以拓展到其他含有内源标记的模型体系中，甚至可以被用于研究存在动态生物过程或对有扰动的相互作用进行重构。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586

-023-06739-5

参考文献

参考文献

1. Gavin, A.-C. et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature 415, 141–147 (2002).

2. Krogan, N. J. et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature 440, 637–643 (2006).

3. Gavin, A.-C. et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature 440, 631–636 (2006).

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

微信号：FRCBS-THU

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